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实验一、普通光学显微镜的使用及细菌形态的观察

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实验一 普通光学显微镜的使用及细菌形 态的观察
主 讲:徐尔尼 生命科学学院生物技术系

一、目的与要求
? 了解显微镜的构造和各部分的作用,掌握显微镜的 了解显微镜的构造和各部分的作用,
使用方法 ? 学习并掌握油镜的原理和使用方法 ? 了解细菌的三种基本形态

二、显微镜的基本结构及油镜的工 作原理
1、普通光学显微镜的基本结构
普通光学显微镜的构造可分为两部分: 普通光学显微镜的构造可分为两部分: 1)机械装置:镜座、镜筒、镜臂、物镜转换器、载物 机械装置:镜座、镜筒、镜臂、物镜转换器、 台、标本移动螺旋、粗调螺旋和细调螺旋等部件组成。 标本移动螺旋、粗调螺旋和细调螺旋等部件组成。 2)光学系统:目镜、物镜、聚光器、虹彩光圈、光源 光学系统:目镜、物镜、聚光器、虹彩光圈、 等组成

普 通 光 学 显 微 镜 基 本 构 造

放大倍数= 放大倍数= 物镜放大倍 数×目镜放 大倍数

在显微镜的光学系统中,物镜的性能最为关 在显微镜的光学系统中,物镜的性能最为关 键,它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光 它直接影响着显微镜的分辨率。 学显微镜配置的几种物镜中, 学显微镜配置的几种物镜中,油镜的放大倍数最 大,对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比, 对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比, 油镜的使用比较特殊,需在载玻片和镜头之间加 油镜的使用比较特殊, 滴镜油。 滴镜油。

二、显微镜的基本结构及油镜的 工作原理
2、油镜的工作原理
1)增加照明亮度 2) 增加数值孔径(NA),提高显微镜的分辨率 增加数值孔径(NA),

三、实验器材
1、标本片:细菌三形片 标本片: 2、试剂:香柏油、二甲苯 试剂:香柏油、 3、仪器及其它用具:显微镜、擦镜纸等 显微镜、

四、操作步骤
1、显微观察步骤
1)低倍镜观察(10×): 低倍镜观察(10× 2)高倍镜观察(40×): 高倍镜观察(40× 3)油镜观察(100×): 油镜观察(100×

低倍镜的操作
置显微镜于固定的桌上。 1. 置显微镜于固定的桌上。 旋动转换器,将低倍镜移到镜筒下方与之对直。 2. 旋动转换器,将低倍镜移到镜筒下方与之对直。 转动反光镜向着光源处,同时用眼对准目镜, 3. 转动反光镜向着光源处,同时用眼对准目镜,仔细观 察,视野亮度均匀。 视野亮度均匀。 将标本放在载物台上, 4. 将标本放在载物台上,使观察的目的物置于圆孔的正 中央。 中央。 将粗调节器向下旋转,眼睛注视物镜, 5. 将粗调节器向下旋转,眼睛注视物镜,以防物镜和载 玻片相碰,当物镜的尖端距载玻片约0.5cm处时停止旋转。 玻片相碰,当物镜的尖端距载玻片约0.5cm处时停止旋转。 0.5cm处时停止旋转 左眼向目镜观察,调节粗、 6. 左眼向目镜观察,调节粗、细调节器直至目的物清晰 为止。 为止。

高倍镜的操作
使用高倍镜之前,先用低倍镜观察, 1. 使用高倍镜之前,先用低倍镜观察,将目的物移至视 野正中央。 野正中央。 旋动转换器换成高倍镜, 2. 旋动转换器换成高倍镜,调节细调节器直至目的物清 晰;如果高倍镜触及载玻片应立即停止旋动,说明原来低 如果高倍镜触及载玻片应立即停止旋动, 倍镜没有调准焦距,应重调低倍镜,找到目的物。 倍镜没有调准焦距,应重调低倍镜,找到目的物。

油镜的操作
如果用高倍镜未能看清目的物,则可用油镜。 1. 如果用高倍镜未能看清目的物,则可用油镜。应先用 低倍镜和高倍镜检查标本片,将目的物移到视野正中。 低倍镜和高倍镜检查标本片,将目的物移到视野正中。 2.下降载物台在载玻片上滴一滴香柏油, 下降载物台在载玻片上滴一滴香柏油 2.下降载物台在载玻片上滴一滴香柏油,将油镜移至正中 央,使油镜头浸没在油中,刚好贴近载玻片。用细调节器 使油镜头浸没在油中,刚好贴近载玻片。 微微向上调即可。 微微向上调即可。

四、操作步骤
2、显微镜用毕后的处理
拔掉电源插头 头上的香柏油 的残留油迹 下降载物台 取干净擦镜纸拭去镜

取干净擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上 取干净擦镜纸擦去残留的二甲苯 将

显微镜的各部位还原,物镜转成“ 显微镜的各部位还原,物镜转成“八”字形,擦干净镜体, 字形,擦干净镜体, 罩上防尘罩。 罩上防尘罩。

五、实验数据及处理结果
绘出你在油镜下观察到的细菌的三种形态及 其不同细菌细胞的排列方式。 其不同细菌细胞的排列方式。

六、思考与讨论 六、思考与讨论
用油镜观察时应注意那些问题? 用油镜观察时应注意那些问题?在载玻片和镜头 之间加滴什么油?起什么作用? 之间加滴什么油?起什么作用? 下次实验项目名称:细菌的简单染色和革兰氏染色 下次实验项目名称:

增加照明亮度
油镜的放大倍数可达100× 油镜的放大倍数可达100× ,放大倍数这样大的镜 100 头,焦距很短,直径很小,但所需要的光照强度却最大。 焦距很短,直径很小,但所需要的光照强度却最大。

从承载标本的玻片透过来的光线,因介质密度不同( 从承载标本的玻片透过来的光线,因介质密度不同(从 玻片进入空气,再进入镜头),有些光线会因折射或全反射, 玻片进入空气,再进入镜头),有些光线会因折射或全反射, ),有些光线会因折射或全反射 不能进入镜头,致使在使用油镜时会因射入的光线较少, 不能进入镜头,致使在使用油镜时会因射入的光线较少,物 像显现不清。所以为 像显现不清。 了不使通过的光线有所损失, 了不使通过的光线有所损失, 在使用油镜时需在油镜和玻 片之间加入与玻璃的折射率 片之间加入与玻璃的折射率 相仿的镜油( 相仿的镜油(通常使用香柏 油,其折射率n =1.52)。 其折射率n =1.52)。 增加了视野的进光量, 增加了视野的进光量,从而 使物象更加清晰。 使物象更加清晰。

增加显微镜的分辨率
显微镜的分辨率或分辨力( 显微镜的分辨率或分辨力(resolution or resolving power)是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。 power)是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。从 物理学角度看,光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用 物理学角度看, 物镜性能的限制,可表示为: 物镜性能的限制,可表示为:

分辨率 D=

λ
2 NA

式中:λ=光波波长(平均0.55? 式中:λ=光波波长(平均0.55?m) 光波波长 0.55 NA=物镜的数值孔径值。 NA=物镜的数值孔径值。 物镜的数值孔径值

数值孔径则取决于物镜的镜口 角和玻片与镜头间介质的折射率, 角和玻片与镜头间介质的折射率, 可表示为: 可表示为:

NA=n sin(α/2) NA=n· sin(α/2)
n: 物镜和被检标本间介质的折 射率。 射率。 镜口角。 α:镜口角。 以香柏油为介质的油镜所能达 一般在1.2 到的数值孔径(NA一般在 到的数值孔径(NA一般在1.2 ~1.4)要高于低倍镜、高倍镜 1.4)要高于低倍镜、 等物镜(NA都低于1.0)。数值孔径通常在0.65左右的 等物镜(NA都低于1.0)。数值孔径通常在0.65左右的 都低于1.0)。数值孔径通常在0.65 高倍镜只能分辨距离不小于0.4μ 的物体, 高倍镜只能分辨距离不小于0.4μm的物体,而油镜的 0.4 分辨率却可达到0.2μ 左右。 分辨率却可达到0.2μm左右。 0.2

实验报告格式
一、实验项目名称 二、实验目的 三、实验基本原理 四、主要仪器设备及耗材 五、实验步骤 六、实验数据及处理结果 七、思考讨论题



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