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液相色谱_串联质谱法测定牛奶和奶粉中卡巴氧和喹乙醇代谢物的残留量_图文

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第 29 卷第 2010 年 2

2期 月

             Chinese

分析试验室 Journal of Analysis

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            Vol. 29. No. 2010 - 2

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液相色谱2串联质谱法 测定牛奶和奶粉中卡巴氧和喹乙醇代谢物的残留量

林  黎 Ξ1 , 谢丽琪1 , 欧阳姗1 , 梁  宏1 , 叶  刚1 , 廖菁菁1 , 庞国芳2
(1. 深圳出入境检验检疫局 , 深圳 518067 ; 2. 秦皇岛出入境检验检疫局 , 秦皇岛 066000)

摘  要 : 建立了牛奶和奶粉中卡巴氧代谢物喹喔啉222羧酸 (QCA) 和喹乙醇代谢 物 32甲基喹喔啉222羧酸 (MQCA) 残留量的液相色谱2串联质谱测定方法 。将样品 经 0. 6 % (体积分数) 的甲酸溶液进行消化 , 用 Tris 缓冲溶液调节 pH 后 , 加入 Protease 蛋白酶进行酶解 , 样品溶液用 0. 3 molΠL HCl 溶液酸化后 , 采用阴离子 交换固相萃取柱 Oasis MAX 进行净化和富集 。分析样品以 0. 1 % (体积分数) 的 甲酸溶液2甲醇2乙腈为流动相 , 经 Inertsil ODS23 色谱柱分离 , 采用负离子扫描 , 在 LC2MSΠMS 多反应监测模式下进行定性及定量分析 。喹口恶啉222羧酸和 32甲基 喹口恶啉222羧酸的方法测定下限牛奶为 015μgΠkg , 奶粉为 410μgΠkg。对牛奶在 015~510 μgΠkg , 奶粉在 410~4010μgΠkg 添加水平的平均回收率为 6812 %~ 8215 % , RSD 为 314 %~12 %。 关键词 : 液相色谱2串联质谱 ; 卡巴氧 ; 喹乙醇 ; 代谢产物 ; 牛奶 ; 奶粉
中图分类号 : O657. 63   文献标识码 : A    文章编号 : 100020720 (2010) 022038204

  卡巴氧 ( Carbadox) 和喹乙醇 (Olaquindox) 同属 喹喔啉类化合物[1 ,2] , 该类药物具有显著的促进动 物生长的作用 , 用作猪等养殖动物的饲料添加剂 , 可以改善动物的生长性能和饲料利用率 。根据 J ECFA 报告中对卡巴氧和喹乙醇的风险评估 , 不 仅二者本身具有潜在的致畸变 、致癌作用 , 二者 的代谢物也可能带来健康风险 。因此许多国家将 卡巴氧和喹乙醇列为对食用动物禁用或限用的药 物 , 欧盟 、中国 、日本 、美国 、澳大利亚等对二者 在动物组织内迅速代谢而产生的相应的代谢产物 喹喔啉222羧酸 (QCA) 和 32甲基喹喔啉222羧酸 (MQ2 CA) 制定了残 留 监 控 的 限 量 标 准 。检 测 QCA 和 MQCA 的方法有液相色谱法[3] 、气质联用法[4] 和液 质联用法[5 ,6] , 但这些方法均是对肉类和肝脏进行 检测 , 到目前还没有对牛奶和奶粉中关于此类药 物残留检验的相关报道 , 为此 , 制定卡巴氧 、喹乙 醇及其代谢物在牛奶和奶粉中的多残留检测方法

是十分必要的 。本方法灵敏度高 、选择性好 , 正确 有效 , 为更全面 、严格监控这类药物的使用和残 留情况提供了依据 。 1  实验部分[7] 1. 1  仪器与试剂
液相色谱2质谱联用仪 (配有电喷雾离子源) , 包括 Agillent 1100 液相色谱系统 (美国 Agillent) , 以 及 API 3000 三级四级杆串联质谱仪 (美国 ABI) ; Inertsil ODS23 色谱柱 : 3μm , 100 mm ×2. 1 mm (内 径) ; 空气浴恒温摇床 ; 低温离心机 ; 氮气浓缩仪 , 固相萃取装置 ; 旋涡混合仪 ; 阴离子交换柱 : Oasis MAX 60 mg , 3 mL 。
除另有规定外 , 所用试剂均为分析纯 , 水为 二 次 去 离 子 水 。甲 醇 、乙 腈 、甲 酸 为 色 谱 纯 。 Protease蛋白酶 (美国 Sigma , P5147 , - 18 ℃以下保 存) , Tris 碱 (美国 Sigma , T1503) 。
标准品 : 喹口恶啉222羧酸 (QCA) ( Sigma 公司) ;

Ξ 收稿日期 : 2009202218 ; 修订日期 : 2009206210 基金项目 : 国家质检总局制标 (200796102T2469) 项目资助 作者简介 : 林  黎 (1971 - ) , 女 , 工程师 ; E2mail : linli1103 @sohu. com
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32甲基喹口恶啉222羧酸 (MQCA) (CSS 公司) ; 喹口恶 啉222羧酸2d4 (QCA2d4) ( RIVM 公司) ; 纯度均 ≥ 99 %。分别准确称取适量标准品 , 用甲醇溶解定 容 , 配成 100 mgΠL 的标准储备液 , 在 - 18 ℃保存 。 1. 2  实验方法 1. 2. 1  色谱条件  色谱柱 : ODS , 3μm , 100 mm × 211 mm (内径) ; 流动相 : 甲醇 、乙腈以及 011 % (体积分数) 甲酸溶液 ( 时间梯度见表 1) ; 流速 : 012 mLΠmin ; 柱温 : 30 ℃; 进样量 : 30μL 。 1. 2. 2  质谱条件  离子源 : 电喷雾离子源 ; 扫描 方式 : 负离子扫描 ; 检测方式 : 多反应检测 ; 分辨 率 : 单位质量分辨率 ; 电喷雾电压 : 5000 V ; 雾化 气流速 : 8. 0 LΠmin ; 气帘气流速 : 7. 0 LΠmin ; 辅助

气流速 : 5. 0 LΠmin ; 离子源温度 : 450 ℃; 定性离 子对 、定量离子对及其他质谱参数见表 2 。

表 1  流动相时间梯度 Tab. 1  Time dragient of mobile phases

时间 tΠmin

流速 qΠ(mLΠmin)

甲醇 Π%

乙腈 Π%

0. 1 %甲酸 Π%

0

0. 2

13

7

80

10. 0

0. 2

45

15

40

10. 1

0. 2

64

16

20

13. 1

0. 2

13

7

80

20. 0

0. 2

13

7

80

化合物 QCA MQCA
QCA2d4

表 2  各种化合物的定性离子对 、定量离子对 、去簇电压 、碰撞电压 、碰撞池出口电压 Tab. 2  MSΠMS parameters of each compound

母离子Πamu

子离子Πamu

扫描时间Πms DPΠeV FPΠeV CEΠeV

172. 9

101. 9 129. 1

100

26

120

23

100

26

120

21

186. 9

102. 0 142. 9

100

26

120

23

100

26

120

21

176. 9

105. 9 133. 1

100

26

130

29

100

26

130

23

CXPΠeV 12 12 12 12 10 10

1. 2. 3  样品前处理  称取 5 g 牛奶样品 , 精确至 0101 g。置于 50 mL 离心管中 , 加入 10 mL 体积分 数 016 %甲酸溶液 , 混匀后置于 (47 ±3) ℃空气浴 恒温摇床中振摇 1 h ; 然后先加入 3 mL 1. 0 molΠL Tris 溶液 , 再加入 0. 3 mL 蛋白酶水溶液 , 充分混 匀后 , 置于 (47 ±3) ℃空气浴恒温摇床中酶解 16 ~18 h 。在酶解后样品溶液中加入 20 mL 0. 3 molΠL HCl , 振荡混匀后离心 15 min , 上清液过滤 。
称取 12. 5 g 奶粉于烧杯中 , 加适量温水将其 溶解 , 冷却至室温后加水至总重量为 100 g , 充分 混匀后将 5 g 样品置于 50 mL 离心管中 , 按上述步 骤进行处理 。
将以上所得滤液全部通过 Oasis MAX 固相萃 取柱 (分别用 3 mL 甲醇和 3 mL 水活化) , 用 V (15 mL 乙酸钠 (0. 05 molΠL , pH 7. 0) ) ∶V (甲醇) = 19∶1 溶液淋洗固相萃取柱 , 真空抽干 15 min 。再分别用 5 mL 甲醇 、3 mL 水 、5 mL 0. 1 molΠL HCl 和 V (3 mL 甲醇) ∶V (水) = 1∶4 溶液分别淋洗 , 然后用 2 mL 乙

酸乙酯淋洗固相萃取柱 , 最后用 3 mL 甲酸乙酸乙 酯溶液洗脱 QCA 和 MQCA , 置于 15 mL 离心管中 , 在 45 ℃用氮气浓缩仪吹干 。准确加入 1. 0 mL 甲 酸2甲醇溶液溶解残渣 , 过 0. 2μm 滤膜 , 供液相色 谱2串联质谱仪测定 , 内标法定量 。 2  结果与讨论 2. 1  提取溶剂的选择
QCA 和 MQCA 等代谢物在牛奶和奶粉中与蛋 白质以结合态存在 , 通常可采用酸水解 、碱水解 或酶解的方式将目标化合物与蛋白组织分离 , 本 方法分别采用 0. 1 molΠL EDTA2Mcllvaine 缓冲溶液 (pH 4) [8] 直 接 均 质 提 取 , 用 甲 酸 酶 解 , 以 及 用 V (乙腈) ∶V (水) = 1∶1 提取相比较 , 酶解的效果最 好 。不仅反应条件最温和 , 且与奶制品分离最为 彻底 。温度和 pH 对酶的生物活性影响极大 , 所以 选用 Protease 蛋白酶进行酶解 , Protease 在 pH 8. 5 、 温度 47 ℃时活性最强 。酶解之前 , 先在样品中加 0. 6 % (体积分数) 的甲酸溶液 , 置于 47 ℃空气浴
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中 1 h , 使牛奶和奶粉中天然存在的酶失活 ; 然后 用 Tris 缓冲溶液调节 pH , 加入 Protease 蛋白酶 , 置 于 47 ℃空气浴中过夜 16~18 h 。 2. 2  不同 pH 比较
比较了在不同 pH 条件下的净化效果 , 结果表 明 , 在 pH 6~7 偏酸性条件下效果最好 , 相比之 下 , pH < 5 和 pH > 8 条件下的回收率都偏低 。 2. 3  固相萃取柱选择
在样品溶液中加入 0. 3 molΠL HCl , 使酶解液 酸化后 , 采用阴离子交换固相萃取柱进行净化 , 本研究对比了 Bond Elute Certify Ⅱ和 Oasis MAX 两 种商用 SPE 柱的效果 , 结果表明 Bond Elute Certify Ⅱ在洗脱之后 , 回收率低 , 挂柱效果明显较差 。而

Oasis MAX 的净化效果和回收率优于前者 , 回收率 较高 。本研究对固相萃取所用溶液 、流速控制 、淋 洗和被测物的洗脱等条件进行优化 , 根据化合物 性质 , 用含体积分数 2 %甲酸的乙酸乙酯洗脱 QCA 和MQCA 。 2. 4  方法的线性关系 、测定低限 、回收率和精密
度 在上述确定的仪器检测条件下 , 取一系列标 准溶液 ( n = 8) , 以分析化合物和内标化合物的峰 面积比为 Y 轴 , 以分析化合物和内标化合物的浓 度比为 X 轴作标准曲线 , 结果表明 , 2 种分析化合 物的浓度与峰面积值呈现良好的线性关系 (如表 3 所示) 。

化合物 QCA MQCA

表 3  各分析化合物浓度与峰面积的线性关系 Tab. 4  The linear relationship of concentration and peak area of each compound

质量浓度 ρΠ(μgΠL)

线性方程

相关系数 r

系列标准溶液数值

0. 5~20 (牛奶)

Y = 0. 0824ρ+ 0. 0372

0. 9998

8

4. 0~160 (奶粉)

Y = 0. 189ρ+ 0. 317

0. 9995

8

0. 5~20 (牛奶)

Y = 0. 0813ρ+ 0. 021

0. 9998

8

4. 0~160 (奶粉)

Y = 0. 246ρ+ 0. 231

0. 9996

8

  选用不含待测组分的牛奶和奶粉空白样品 , 每个添加浓度水平取 10 个平行样 , 进行四浓度水 平添加回收试验 , 平均回收率为 68. 2 %~82. 5 % , RSD 为 3. 4 %~12 %。通过样品添加回收实验 , 确 实本方法对牛奶中 QCA 和 MQCA 的测定下限均为 015μgΠkg , 对奶粉为 4. 0μgΠkg。
参考文献
[1 ]  WHO Food Additives Series , 27

[2 ]  WHO Food Additives Series , 33 [3 ]  邱银生 , 袁宗辉 , 殷居易. 中国兽医学报 , 2003 , 23 :
286 [4 ]  Della W M Sin , Lucy P K Chung , Martin M C Lai. Anal
Chem Acta , 2004 , 508 : 147 [5 ]  M J Hutchinson. Analyst , 2002 , 127 : 342 [6 ]  M J Hutchinson. J Chomatogr B , 2005 , 816 : 15 [7 ]  GBΠT 2074622006  牛 、猪的肝脏和肌肉中卡巴氧和喹
乙醇及代谢物残留量的测定 [8 ]  岳振峰. 分析化学 , 2006 , 9 (34) : 1255

Determination of the residues of metabolites of carbadox and olaquindox in milk and milk powder2LC2MS2MS method LIN Li 3 1 , XIE Li2qi1 , OU Yang2shan1 , LIANG Hong1 , YE Gang1 , LIAO Jing2jing1 and PANG Guo2f ang2 (1. Shenzhen Entry2Exit Inspection and Quarantine Bureau , Shenzhen 518067 ; 2. Qinhuangdao Entry2Exit Inspection and Quarantine Bureau , Qinhuangdao 066000) , Fenxi Shiyanshi , 2010 , 29 (2) : 38~41 Abstract : This study presented a liquid chromatography2tandam mass spectrometry (LC2MSΠMS) method for determi2 nation of residues of Carbadox , Olaquindox and related metabolites quinoxalie222carboxylic acid (QCA) and 32meth2 ylquinoxaline222carboxylic acid (MQCA) in milk and milk powder. As for the extraction of QCA and MQCA , milk and milk powder is first digested with 016 % formic acid to deactivate naturally2occurring enzymes. After overnight enzy2 matic hydrolysis with protease , the tissue extract is acidified , centrifuged and filtered. QCA and MQCA are recovered
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from the tissue extract by using an Oasis MAX solid phase extraction (SPE) cartridge. The analytes are separated on a
Inertsil ODS23 LC column , and qualitatively and quantitatively determined under multi2reaction monitoring (MRM) scan type with tandem mass analyzer using positive polarity mode. The limit of quatitation (LOQ) for the two analytes in milk is 015μgΠkg , in milk power is 410μgΠkg. At the spiked level in the range of 015~510μgΠkg in milk and 410~4010μgΠkg in milk power , the mean recoveries are in the range of 6812 %~8215 % , the relative standard de2 viation are in the range of 314 %~12 %. Keywords : LC2MSΠMS ; Carbadox ; Olaquindox ; Metabolites ; Milk ; Milk powder

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